脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與方法

　　脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。下面讓我們一起來(lái)看看脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與方法吧！

　　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟

　　進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)先規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h，所以要充分了解細(xì)胞生長(zhǎng)速度，計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量，并確認(rèn)準(zhǔn)備好所需試劑：Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，以及DNA。

　　1、細(xì)胞鋪板

　?。?）一般會(huì)選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3-4次，從解凍過(guò)程中恢復(fù)過(guò)來(lái)可以穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，傳代次數(shù)高(>30-40)時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和形態(tài)會(huì)改變。

　?。?）如果提總蛋白，一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因?yàn)檗D(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能達(dá)到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對(duì)比較少。

　?。?）傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。對(duì)于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細(xì)胞)。

　?。?）轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時(shí)間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降，如果是簡(jiǎn)單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來(lái)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞密度保持在匯合率為70-90%（這個(gè)前提是轉(zhuǎn)染24h，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%），細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時(shí)進(jìn)行。

　　2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無(wú)血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒；B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成完q培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(shí)（不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該摸一個(gè)最佳配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來(lái)檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過(guò)觀察每組熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷轉(zhuǎn)染效率）。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。

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