流式細(xì)胞儀的常見問題有哪些？

流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)作為一種強(qiáng)大的單細(xì)胞分析工具，可以對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。那么流式細(xì)胞儀的常見問題有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、抗體孵育時(shí)間過長會影響檢測結(jié)果嗎？

通常情況下，標(biāo)記細(xì)胞表面抗原的熒光抗體需要在室溫孵育20-30分鐘。

對于一些狀態(tài)較脆弱的細(xì)胞（例如從組織中分離、培養(yǎng)的免疫細(xì)胞），切勿過長時(shí)間孵育，同時(shí)建議使用染色緩沖液（Staining Buffer），其中主要成分為PBS，疊氮鈉和胎牛血清，胎牛血清可以減少抗體的非特異性結(jié)合，疊氮鈉可以維持細(xì)胞表面抗原的穩(wěn)定性。

對于胞內(nèi)或者核內(nèi)標(biāo)記抗體，可以在固定、破膜后適當(dāng)延長孵育時(shí)間，或者破核膜同時(shí)孵育核內(nèi)抗體。

二、樣本不能及時(shí)上機(jī)檢測，血樣和組織樣本的保存方法？

通常情況下建議樣本處理至表面抗體孵育結(jié)束，再用1%多聚甲醛重懸固定4℃保存至下一步，或者4%多聚甲醛固定10分鐘后洗去，用StainingBuffer重懸，4℃保存至下一步，48小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測。如不具備前處理?xiàng)l件，外周血可以使用流式專用保存管存放，組織樣本剪成小塊后用保存液存放，建議不錯(cuò)過3天進(jìn)行前處理和上機(jī)檢測。

三、流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期，各個(gè)周期峰分不開，只有一個(gè)寬峰是為什么？

①如果是持續(xù)出現(xiàn)這種情況，說明儀器的PI檢測通道CV值過高，管路需要深度清潔或者更換。

②前處理過程中出現(xiàn)的問題，如：乙醇固定條件（濃度、時(shí)間）的改變造成通透不wan全、RNA沒有處理wan全、通道CV較差同時(shí)受到異倍體干擾等。

③如果個(gè)別組出現(xiàn)此情況，可能是受到實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件的影響，如：轉(zhuǎn)染的熒光干擾、集中在周期區(qū)間的抑制、對細(xì)胞影響過大等。

四、鈣離子（Ca2+）流式檢測如何設(shè)置對照？

Ca2+檢測通常使用Fluo-3、Fluo-4等熒光探針，這類探針通常會在活細(xì)胞內(nèi)與鈣離子結(jié)合發(fā)出熒光，進(jìn)行相關(guān)成像或流式檢測。因此鈣離子檢測會有靜態(tài)檢測和動(dòng)態(tài)檢測兩種方法。

靜態(tài)檢測主要用于檢測相對胞內(nèi)濃度變化，需要設(shè)置空白對照、陰性對照、陽性對照，以相對的方式檢測熒光值。

動(dòng)態(tài)檢測主要用于檢測鈣動(dòng)員的情況，監(jiān)測加入刺激劑后的Ca2+變化情況。通常用于檢測一些免疫細(xì)胞，也可以用于分析不同淋巴細(xì)胞亞群的變化情況。

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