如何處理PCR反應中的污染？

PCR反應的特點是具有較大擴增能力與靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。那么我們該如何處理PCR反應中的污染呢？讓我們一起來看看吧！

一、環(huán)境污染

1.稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。

2.紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。

在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。

二、反應液污染

1.DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列。

2.內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR。

3.紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法。

4.g射線輻射法：1.5kGy的輻射可wan全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。

三、RS-PCR法（RNA-specific PCR）

也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A區(qū))有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物(C)以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進行擴增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴增。

四、抗污染引物法

該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現(xiàn)預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

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