細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些事兒

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：

材料：293T細(xì)胞（其他的細(xì)胞系種類）、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）

器材：20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭、酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD

1、細(xì)胞傳代培養(yǎng)：取出細(xì)胞群，去除培養(yǎng)基，使用PBS清洗2次。

用Tip頭加入1ml Trypsin液（胰蛋白酶），消化1分鐘（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞*從壁上脫落下來(lái)為止。

加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞*分散開。

將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞放入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染（當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50-80%時(shí)，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染）。

轉(zhuǎn)染過(guò)程：

1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

3）將混合液在室溫放置10—15分鐘。

4）吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。

5）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

6）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)。

第二次細(xì)胞傳代

1）在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2）再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)皿中。

3）在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。

篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞：

1．確定抗生素作用的理想濃度：

不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn)，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的作用濃度。

1) 提前24 小時(shí)在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞，接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。

3) 培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別，維持時(shí)使用篩選濃度的一半。最終得到和合適的抗生素濃度。

2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。

3．轉(zhuǎn)染72 小時(shí)后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。

1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24 孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中,長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2) 有限稀釋法：將細(xì)胞通過(guò)酶消化下來(lái)后做連續(xù)的10 倍稀釋（10^-2—10^-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96 孔板中培養(yǎng)，7-10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆。

4. ELISA 或Western blot 檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。