CST抗體選擇指南

很多剛剛開始信號通路研究的朋友，在訪問CST網(wǎng)站查找抗體的時候，常常被多個抗體貨號和不同的抗體信息所困擾，不知道該如何選擇合適的抗體。為此，CST的技術(shù)支持團隊希望通過這篇文章，系統(tǒng)介紹抗體的相關(guān)背景知識，為大家正確選擇適合自身研究需要的CST抗體提供幫助。

一、CST抗體的制備工藝

根據(jù)抗體制備的原理和方法，主要分為單克隆抗體、多克隆抗體和基因工程抗體三大類。

早期傳統(tǒng)的抗體制備方法是將抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，由于抗原物質(zhì)具有多種抗原決定簇，故可刺激產(chǎn)生多種抗各種決定簇的抗體,形成細胞克隆，合成和分泌抗體到血清或體液中，故在其血清中實際上是含多種抗體的混合物，這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體（polclonal antibody, Pab），也是di一代抗體。由于這種抗體是不均一的，無論是對抗體分子結(jié)構(gòu)與功能的研究或是臨床應(yīng)用都受到很大限制，因此如何能獲得均一性抗體成為關(guān)注的問題。

如能將所需要的產(chǎn)生抗體的細胞株系選出并能在體外進行培養(yǎng)即可獲得特異的單克隆抗體（monoclonal antibody, Mab），它是由識別一種抗原決定簇y的細胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，目前很多單克隆抗體大都利用雜交瘤細胞技術(shù)產(chǎn)生，這種用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體可視為第二代抗體。單克隆抗體由于純度高、特異性強、可以提高在各種抗體應(yīng)用中檢測抗原的敏感性及特異性，已經(jīng)被廣泛采用。

CST的單克隆抗體主要為兔源和鼠源兩大類。由于CST在單克隆抗體的細胞克隆篩選和多種應(yīng)用的驗證等方面非常嚴格，保證了CST單克隆抗體保持著業(yè)界的水平。目前，CSTgao品質(zhì)的抗體被稱為XP^®（eXceptional Performance）的單克隆抗體，這些抗體無論在效價、應(yīng)用類型和種屬、特異性等方面的表現(xiàn)都更加，也是我們重點推薦的新一代產(chǎn)品。

由于需要研制人源單克隆抗體用于臨床治療，基因工程抗體(genetically engineering antibody)技術(shù)在80年代早期興起。這一技術(shù)是將對Ig基因結(jié)構(gòu)與功能的了解與DNA重組技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)研究者的意圖在基因水平對Ig分子進行切割、拼接或修飾，甚是人工合成后導入受體細胞表達，產(chǎn)生新型抗體，也稱為第三代抗體。

基因工程抗體包括嵌合抗體、重構(gòu)抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體及抗體庫等。CST近年來一直致力于新型基因工程抗體的研究并嘗試用于治療性抗體開發(fā)，并于2012年*在《Nature Biotechnology》雜志公布的研究進展——A proteomics approach for the identification and cloning of monoclonal antibodies from serum，CST將這種技術(shù)稱為NG-XMT™技術(shù)，這是一種結(jié)合了下一代測序技術(shù)（NG-sequencing）和蛋白組學技術(shù)從抗血清中進行克隆篩選和鑒定的基因工程抗體制備工藝，能夠大大提高治療性單克隆抗體制備的效率。

二、CST一抗（primary antibody）的選擇

正確選擇CST一抗一般需要如下幾個方面的信息：

1）蛋白的名稱及亞型：某些蛋白具有多種不同的亞型，如IKK、PKC、p38等，這需要在選擇抗體之前確定要研究的蛋白亞型。還有些抗體由于其抗原選擇的是不同蛋白亞型共有的肽段區(qū)域，是可以同時識別多個亞型的，我們一般都會在抗體的名稱中加入（pan）字樣來標明，如Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691，就可以識別Akt1、2、3等多個亞型，結(jié)果反映的也是所有Akt亞型的總水平。

2）磷酸化修飾位點：由于CST抗體有很多是針對蛋白的磷酸化修飾位點，因此CST抗體的命名往往會在蛋白名稱后加上括號來標注，如Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody #9451，Ser65即此抗體識別的修飾位點，在選擇合適的CST抗體用于特定修飾位點研究時，需要特別注意。有關(guān)不同修飾位點的功能，可以通過查閱文獻確定，或登陸phosphosite.org（目前zui全的蛋白修飾位點數(shù)據(jù)庫）查詢，也可以通過點擊CST網(wǎng)站該產(chǎn)品頁面中的Background（背景知識）來獲取。另外，由于有的蛋白存在不同亞型且序列高度同源，而不同亞型的某些磷酸化修飾位點周圍的序列*相同，因此CST的某些抗體往往會同時識別不同亞型的相似修飾位點，如Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb #2697既可識別Ser176位點磷酸化的IKKα，也可以識別Ser180位點磷酸化的IKKβ，結(jié)果反映的也是兩者共有的水平。

3）抗體已驗證的應(yīng)用（如WB，IHC，IP等）：CST抗體一般會在出廠前對常見的抗體應(yīng)用（WB，IHC，IP, ChIP，IF，F(xiàn)low）進行內(nèi)部驗證，以確定可以滿足的不同應(yīng)用要求。通過驗證，達到質(zhì)檢要求的抗體會明確標記，以備參考。一些沒有標明的應(yīng)用，往往是因為經(jīng)過驗證沒有達到質(zhì)檢標準而不推薦。比如Acetyl-Histone H3 (Lys18) (D8Z5H) Rabbit mAb #13998可以滿足除IF以外的所有其他5種應(yīng)用，有的客戶會認為，既然該抗體可以用于IHC，根據(jù)經(jīng)驗推斷應(yīng)該可以用于IF，那么很有可能會浪費很多時間和試劑而不能獲得結(jié)果。也有一些沒有標明的應(yīng)用，可能是因為我們沒有用于檢測的樣本而沒有檢測CST不推薦您使用沒有標明的應(yīng)用。可以挑選其他的貨號，我們可能有適用于這個應(yīng)用的更好的其它產(chǎn)品。

另外，一般直接帶有偶聯(lián)物的一抗，只能用于特定的應(yīng)用，也會明確標記。

4）抗體能夠識別的樣本種屬：CST抗體一般會在出廠前對常見的不同種屬目標樣本進行內(nèi)部驗證，以確定可以滿足的不同種屬類型，可以在產(chǎn)品頁面的Species-Reactivity一欄中看到（如人、小鼠、大鼠等）。通過驗證，達到質(zhì)檢要求的種屬會明確標記，以備參考。對于有些抗體，在 Species-Reactivity 的種屬里，有些種屬會加上括號，這表示根據(jù)序列同源比對，是100%符合的，但是我們并沒有做過關(guān)于這些種屬的實驗，所以不建議使用。

一些沒有標明的種屬，也有可能是可以應(yīng)用的，建議通過聯(lián)系CST技術(shù)支持來獲得相關(guān)抗原序列比對的信息，以確定是否可以用于該種屬的樣本。

5）CST制備抗體的抗原：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片段、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，CST抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片段或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。不同類型的抗原對所得到的抗體會對其應(yīng)用產(chǎn)生一定影響。CST科學家一般都會對抗體制備所用的抗原進行說明，并對抗體的各種常規(guī)應(yīng)用在出廠前進行驗證，以確定該抗體能夠滿足的應(yīng)用。

6）抗體的動物來源：CST一抗（primary antibody）的動物來源多為兔（rabbit）和小鼠（mouse），動物來源和單/多抗信息可通過產(chǎn)品名稱和產(chǎn)品頁面或說明書的Source / Purification得到。由于很多抗體的應(yīng)用（如IHC，IF等）需要通過第二抗體（二抗）的進一步結(jié)合和信號放大，而第yi抗體是通過特定抗原免疫動物而獲得，產(chǎn)生抗體的動物來源也決定著第二抗體的選擇。一般說來，在使用無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗。

7）抗體的克隆號（如D6B6）：CST的某些抗體會含有克隆篩選過程中確定的原始克隆位置編號信息，如Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407中的53A5就是原始的克隆號。這些信息一般對于抗體選擇沒有太大的影響，只是當同樣的修飾位點有不同的克隆來源時，用克隆號標注以示來源不同。

8）抗體的規(guī)格：CST抗體一般有3種規(guī)格，分別是40 µl ( 4 western blots )、100 µl ( 10 western blots ) 和300 µl ( 30 western blots )。zui為常見的是100 µl ( 10 western blots )。10 western blots 代表該抗體可以做 10 次標準 western blots 膜的孵育，即大約可做100個樣本。具體計算如下：該抗體用于 WB 的稀釋比例為 1:1000，我們假定一張膜多用 10 ml 一抗工作液孵育，那么，需用 10ml 的 TBST, 按照說明書上建議的 5%BSA 或者 5% non-fat milk, 加入 10ul 的抗體配置成一抗工作液。因此，100ul 一抗原液可用于 10 次 western blots。

以查找ISG15抗體為例，先登陸CST公司網(wǎng)站，然后在 Search方框里輸入ISG15，會出來#2578和#2743這兩個抗體，讓我們看一下它們的區(qū)別：#2758 是個兔單抗，括號里的 22D2 代表克隆號，可以做的實驗是 Western(免疫印跡)、IP(免疫沉淀)，可應(yīng)用的種屬是 H(人)和 Hr(馬)；#2743 是個兔多抗(可查看產(chǎn)品信息頁面“Source / Purification”部分)，可以做的實驗是 Western、F( 流式細胞術(shù) )、E-P( 以肽為包被抗原的 ELISA)，應(yīng)用的種屬是 H、M(小鼠)、Mk(猴子)。如果說你要做 Western，所用的樣本來自人，那么這兩個抗體都是可以的。

三、CST二抗（secondary antibody）的選擇

二抗的選擇先要考慮一抗的物種來源，例如：如果選擇的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。其次，二抗的選擇要考慮具體的應(yīng)用類型，CST提供的二抗根據(jù)不同的應(yīng)用分為兩大類：酶聯(lián)（HRP或AP偶聯(lián)）二抗（免疫印跡和免疫組化應(yīng)用）和熒光二抗（免疫熒光和流式應(yīng)用）。

二抗連接的標記酶多為辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP），標記酶通過生化反應(yīng)與其底物產(chǎn)生有顏色的沉淀物，從而顯示目的蛋白的位置和含量，一般常見各種底物信息如下：

而熒光標記物用特殊波長的光激發(fā)時發(fā)射出可見光，CST采用的熒光標記物多為Alexa Fluor^®系列染料，分別為Alexa Fluor^®488、555，594和647。另外，CST還具有非可見光區(qū)的染料偶聯(lián)抗體，主要使用的Dylight系列染料，分別為DyLight™680和DyLight™800 Conjugate。這些熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長信息如下。

CST還有一些特殊的二抗用于特定的應(yīng)用，如構(gòu)象特異性或單鏈特異性二抗，是為了防止在免疫沉淀（IP）這一應(yīng)用中二抗與微珠結(jié)合的抗體在后續(xù)的WB檢測中發(fā)生交叉反應(yīng)而特別設(shè)計的。